茯磚茶是一種后發(fā)酵茶（屬黑茶類），是青藏高原、蒙古高原以及絲綢之路兩側(cè)的牧民日不可少的飲料，并被稱為神秘之茶。民間常將其作為一種治療腹瀉的偏方，并有研究資料證明茯磚茶有很好的抗腹瀉效果[1】。致瀉的原因有多種，主要腹瀉有滲透性腹瀉、分泌性腹瀉、滲出性腹瀉（炎癥性腹瀉）及腸道運(yùn)動(dòng)功能異常性腹瀉等，一般情況下細(xì)菌可能導(dǎo)致分泌性腹瀉、滲出性腹瀉。茶葉是一種純天然飲料，含有多種活性成分，對(duì)微生物（包括細(xì)菌、病毒、絲狀真菌等）具有廣譜抗性，對(duì)多種病原微生物的生長(zhǎng)有明顯抑制作用。近年來，國(guó)內(nèi)外的一些學(xué)者對(duì)茶葉具有抑菌作用的化學(xué)組分和機(jī)理有一定的研究2-5]，但有關(guān)茯磚茶的殺菌作用還鮮見報(bào)道。本研究選用常易引起動(dòng)物腹瀉的幾種菌，探討不同年份茯磚茶的水提取物對(duì)其抑菌效果，比較不同陳化程度的茯磚茶的抑菌活性，為分析茯磚茶的藥理功效做些基礎(chǔ)研究，對(duì)進(jìn)一步擴(kuò)大其銷量具有十分重要的意義。
一、材料與方法
1．材料
取湖南益陽茶廠于1996、2002和2009年3個(gè)不同年份生產(chǎn)的茯磚茶，分別粉碎后過20目篩備用。
試驗(yàn)菌種：大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏桿菌（SaLnorzella）、溶血性鏈球菌（Streptococcus hemolyticus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus su,btilis）、志賀氏菌（Shigella），均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院微生物研究室提供。
2．主要儀器與設(shè)備
R-100旋轉(zhuǎn)濃縮儀（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），H-2050R離心機(jī)（長(zhǎng)沙市八方科學(xué)儀器有限公司），HH數(shù)顯恒
溫水浴鍋（金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠），LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌器（上海醫(yī)用核子儀器廠），SW-CJ-2D名牌之星凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），ZD-85榮華氣浴恒溫振蕩器（長(zhǎng)沙八方科學(xué)儀器有限公司），鑷子、接種環(huán)、酒精燈、培養(yǎng)皿、無菌過濾頭、鋁質(zhì)烘皿、規(guī)玻璃儀器、抽濾裝置等。
3．主要試劑
酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、三氯化鋁等試劑均為分析純。
4．試驗(yàn)方法
(1)茯磚茶水提物的制備。茯磚茶水提物的制備參照文獻(xiàn)[6]，將茯磚茶粉碎，按茶水比1:15用沸水浸提茶葉30rmn，兩層紗布過濾，濾液經(jīng)4500 rpm離心15min后濃縮，制成相當(dāng)于含茯磚茶原料l.Og/mL濃度的提取液，放入高壓蒸氣滅菌鍋中，經(jīng)121.3C、20min高壓滅菌后，冷卻備用。(2)培養(yǎng)基和茯磚茶水提物的藥敏紙片制備。牛肉膏湯、瓊脂培養(yǎng)基及藥敏紙片的制備均參考文獻(xiàn)[7]。
(3)試驗(yàn)菌活化培養(yǎng)、活菌計(jì)數(shù)和供試菌液的制備按參照文獻(xiàn)[ 8-9]。
(4)藥敏紙片法抑菌試驗(yàn)。按參照文獻(xiàn)[10]。
(5)最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定。按參照文獻(xiàn)[11]略作優(yōu)化，將配置的固體培養(yǎng)基在121.30C、O.lMPa條件下滅菌20min，當(dāng)滅菌培養(yǎng)基冷卻至60。C左右時(shí)，在無菌條件下準(zhǔn)確量取不同體積的茯磚茶提取液加入固體培養(yǎng)基中，配制成濃度lOOmg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.13mg/mL、1.56mg/mL和0.78mg/mL的茯磚茶水提取液濃度系列培養(yǎng)基，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)。不加茯磚茶提取物液的培養(yǎng)基為陰性對(duì)照。冷卻凝固后，每平皿加入O.lmL的菌懸液，涂勻，將細(xì)菌置于37C下培養(yǎng)24h，觀察生長(zhǎng)情況以不長(zhǎng)菌的最低提取物溶液濃度為該提取物的最低抑菌濃度。
(6)茯磚茶茶多酚及黃酮類化合物含量測(cè)定參考文獻(xiàn)[12]。
二、結(jié)果與分析
1．六種細(xì)菌培養(yǎng)物菌落形成單位的測(cè)定
結(jié)果見表1。37C環(huán)境下培養(yǎng)24h，6種細(xì)菌培養(yǎng)物活菌數(shù)從大到小依次為大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、枯草芽孢桿菌。將各菌的菌原液稀釋到105cfu/mL，根據(jù)各菌的活菌數(shù)排列，從大到小依次需稀釋104倍、104倍、103倍、102倍、102倍和10倍。
2．藥敏紙片法測(cè)定茯磚茶提取物的抑菌效果
結(jié)果見表2。2009和2002兩年份生產(chǎn)的茯磚茶水提取物對(duì)不同供試細(xì)菌都有一定的抑制作用，而1996年生產(chǎn)的茯磚茶水提取物僅對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌有抑制作用。2009年生產(chǎn)的茯磚茶水提取物對(duì)志賀氏菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達(dá)到20.40mm:t0.87mm，其次是沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、溶血性鏈球菌、大腸桿菌，對(duì)大腸桿菌
的抑菌圈只有10.95mm±0.53mm。2002年生產(chǎn)的茯磚茶水提取物對(duì)志賀氏菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑有18.10mm±0.91mm，其次是沙門氏菌、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌。1996年生產(chǎn)的茯磚茶水提取物僅對(duì)沙門氏菌和大腸桿菌有抑制作用，且效果不太明顯，對(duì)其他4種供試菌沒有明顯的抑制效果。綜合來看，茯磚茶的保存時(shí)間越長(zhǎng)，其抑菌效果越差。
3．茯磚茶提取物的最低抑菌濃度( MIC)檢測(cè)
結(jié)果見表3。2009年生產(chǎn)的茯磚茶提取物對(duì)志賀氏菌的MIC值最小，為1.56mg/mL，2002年生產(chǎn)的茯磚茶提取物對(duì)志賀氏菌和沙門氏菌的MIC值最小，為3.13mg/mL，1996年生產(chǎn)的大腸桿菌和沙門氏菌的MIC值最小，為50mg/mL。4．茯磚茶主要化學(xué)成分的測(cè)定結(jié)果
結(jié)果顯示，不同年份茯磚茶的內(nèi)含成分的差別很大，隨著茯磚茶貯存時(shí)間的增加幾種主要的化學(xué)成分相應(yīng)減少，2009年生產(chǎn)的茯磚茶多酚類及黃酮類化合物含量分別為13.24%及6.12%，2002年生產(chǎn)的分別含有12.50%和6.48%．1996年生產(chǎn)的只有4.79%和2.21%，減少得較多。
三、討論
茯磚茶中含有多種有效成分，如茶多酚、咖啡堿、多糖、維生素等。茶多酚具抗氧化、抑菌作用，特別對(duì)葡萄球菌、腸內(nèi)細(xì)菌、肺炎桿菌、黃曲霉菌、金黃色鏈球菌等有顯著的抑制作用[13]。黃酮類化合物是藥用植物中一大類有效成分，具有多種生物活性，低濃度能抑菌，高濃度能殺菌[14]。
本研究的結(jié)果顯示2009年生產(chǎn)的茯磚茶抑菌效果最好，2002年的次之，1996年的茶最差，說明茯磚茶存放的時(shí)間越長(zhǎng)其抑菌效果越差。茯磚茶在存放過程中，由于微生物作用、濕熱作用和自動(dòng)氧化作用等綜合因素的影響，茶葉中的內(nèi)含成分發(fā)生一系列變化，其中茶多酚和黃酮類的含量減少較多，這兩種成分均是抑菌活性成分，因此導(dǎo)致茯磚茶越陳其抑菌效果就越差。
提取物體外的抑菌強(qiáng)弱與提取物成分組成及濃度密切相關(guān)，但大多數(shù)藥用植物水提取物濃縮至較高的濃度時(shí)，往往會(huì)變得粘稠，這種提取物成分復(fù)雜，常含有生物堿、黃酮類、鞣質(zhì)及沒食子酸的衍生物、有機(jī)酸等多種抗菌、抑菌成分，也有蛋白質(zhì)、淀粉、多糖、樹脂等無抑菌作用的成分㈣。本試驗(yàn)所用茯磚茶提取物，未作醇沉去雜，對(duì)各細(xì)菌的抑菌作用可能會(huì)有一定影響，顯示僅對(duì)部分菌種有較強(qiáng)的抑菌作用。
本研究采用藥敏紙片法和二倍稀釋法研究茯磚茶提取物抑菌效果，此兩種方法均是測(cè)定抑菌作用大小的有效方法。藥敏紙片法操作簡(jiǎn)便，抑菌圈直徑大小也可作一種定量測(cè)定指標(biāo)，但不夠精確，可用于篩選藥物；二倍稀釋法是一種精確定量的方法，但操作較為復(fù)雜，可作為最后精確測(cè)定方法。
總的來說，茯磚茶提取物對(duì)致腹瀉微生物有較好的抑菌效果，說明茯磚茶對(duì)細(xì)菌性致瀉有一定的抑制作用，但隨著陳化時(shí)間越長(zhǎng)，其抑菌效果越差。
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