O引言
茶作為當今世界三大飲料之一越來越受到人們的歡迎。尤其是近年來，人們生活水平逐步提高，對茶飲料的保健功能越來越重視。研究表明，作為茶葉中活性組分之一的茶多糖（TPS），具有抗氧化、抗血栓、降血糖、增強機體免疫能力等多種活性。隨著人們對多糖生物學功能的深入認識，從各種天然產(chǎn)物中提取的生物活性多糖的研究成為人們關注的焦點。20世紀90年代初，日本學者清水岑夫認為茶葉中治療糖尿病的藥理成分為茶葉多糖，此后有關茶葉多糖的研究報道逐年增多。在茶葉加工過程中有大量的枝葉和灰末等副產(chǎn)品未被利用，因此從這些粗老茶葉和茶葉生產(chǎn)的副產(chǎn)品中提取茶多糖作為保健食品的功能因子，則可變廢為寶。微波輔助浸提技術是近年發(fā)展起來的一種新型物理破壁方法，與傳統(tǒng)熱水浸提方法相比，具有節(jié)能、快速、提取效率高等優(yōu)點，已被廣泛用于植物有效成分的提取，尤其是以極性溶劑為萃取劑的浸提過程，但目前尚未在茶多糖加工中使用。福建是一個產(chǎn)茶大省，尤其以鐵觀音茶最為出名。本文用微波輔助浸提鐵觀音茶多糖，采用正交實驗優(yōu)化微波浸提工藝條件，并對微波浸提和常規(guī)浸提產(chǎn)品的抗氧化活性進行比較，為今后茶多糖高效大規(guī)模的生產(chǎn)，提高茶葉的綜合經(jīng)濟效益提供依據(jù)。
1材料與方法
1.1實驗材料
茶葉，市售安溪鐵觀音茶葉。
1.2試劑與儀器
三（羥甲基）胺基甲烷，生化試劑，中國醫(yī)藥集團；鄰苯三酚、鄰二氮菲、鹽酸、過氧化氫、硫酸亞鐵、無水乙醇及其他試劑，如無特殊說明均為分析純。DKZ電熱恒溫振蕩水槽（上海實驗儀器廠）；723PC可見分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）；BS／BT電子天平（德國賽多利斯股份公司）；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-IIID微波爐（上海亞榮生化儀器廠）；TDL一5離心機（上海安亭科學儀器廠）；pH211臺式酸度測定儀（北京哈納科技有限公司）。
1.3實驗方法
1）鐵觀音茶多糖的提取將烘干的鐵觀音茶葉粉碎過篩，經(jīng)乙醚回流脫脂，微波處理一定時間后于60℃熱水浸提兩次，每次2h，抽濾，合并濾液，減壓濃縮，加入5倍體積質(zhì)量分數(shù)95％的乙醇沉淀，低溫靜置過夜，4000r／min離心，沉淀加蒸餾水溶解，再次重復乙醇沉淀的步驟2次，最后一次得到的沉淀用少量水溶解，活性炭脫色后，Sevag法脫蛋白質(zhì)4次，濃縮，真空干燥，得到鐵觀音茶多糖。
2）粗多糖得率的計算多糖含量測定用苯酚一硫酸法。粗多糖得率的計算以1g干品中提取出來的粗多糖占原料總量的百分數(shù)表示，計算公式為：粗多糖得率／％=（O.9×多糖質(zhì)量濃度×提取液體積／原料干重）×100，其中：0.9為葡萄糖的換算系數(shù)；多糖質(zhì)量濃度的單位為ug·mL―1；提取液體積的單位為mL；原料干重的單位為ug。
3）茶多糖對O2―自由基的清除率0。05mol／LTifs-HCI緩沖溶液（pH=8.2）4。4mL，25oC預熱20min，加人不同濃度的茶多糖溶液0.10mL，再加入25℃預熱的2.50mmol／L鄰苯三酚0。50mL，混勻后于25℃恒溫反應4min，然后用10mol／L鹽酸終止反應，于320nm處測定吸光值。清除率按下式計算：O2―清除率／％=（1一（A1一A2）／A0）×100，其中：A0一不含茶多糖溶液的吸光值；A1一含有茶多糖溶液的吸光值；A2一含茶多糖但不含鄰苯三酚溶液的吸光值。
4）茶多糖對·OH自由基的清除率取0。75mmol／L鄰二氮菲溶液1mL，PBS溶液2mL和蒸餾水1mL，充分混勻后，加0.75mmol／L硫酸亞鐵1mL混勻，加質(zhì)量分數(shù)0.01％的過氧化氫1mL，37℃下保溫60min，于536nm處測其吸光值Ap，用質(zhì)量分數(shù)3O％的乙醇1mL代替1mL過氧化氫，測得吸光值Ag。再用試樣1mL代替1mL蒸餾水，測得吸光值As，根據(jù)：·OH清除率／％=（As一Ap）／（Ag一Ap）×100計算·OH清除率。
2結果與分析
2.1微波提取的正交實驗
根據(jù)單因素實驗，選取微波功率、微波時間、水浴浸提溫度和料液比4個因素，各取3個水平，選用L49三的正交表，以多糖得率為實驗指標，對微波處理的工藝條件進行優(yōu)化，并對結果進行極差及方差分析，確定最適作用條件。正交實驗的方案與結果見表1，方差分析見表2。
由表1極差分析可以看出，隨著微波功率的增加，粗多糖得率呈上升趨勢。微波功率增大，固定物料在單位時間內(nèi)獲得的能量逐步增加，加劇了茶葉纖維素細胞的破裂和組織中多糖物質(zhì)分子及萃取溶劑分子的熱運動，多糖類化合物的溶出與溶劑向組織內(nèi)的滲入相互促進，使二者有更充分接觸的機會，從而使得率增加。但是比較A2、A3水平的差值與A2、A1水平的差值發(fā)現(xiàn)，得率上升速度變慢，這一點在單因素實驗中也得到了驗證，這可能是由于當微波功率太大時，微波對細胞內(nèi)物質(zhì)選擇性加熱的性能差異減少，一些易溶于水的其他物質(zhì)先被溶解，造成多糖得率降低。同時，當其他條件一定時，功率過大，提取液溫度在短時間內(nèi)達到上限值，微波輻射的有效作用時間會有所減短，局部溫度過高會導致多糖類化合物的分解，而且微波功率過大會增加多糖提取成本。本實驗中，從實驗結果直接分析，微波功率應取A3水平，但考慮到A3與A2水平時多糖得率相差不大，并且從最大限度保持多糖生物活性的角度出發(fā)，選取A1水平，即微波功率375w為最佳條件。
微波時間對茶多糖得率的影響與微波功率的影響類似，即隨微波處理時間的增加，茶多糖得率逐漸增大，在B水平時達最大值。微波加熱可使水等極性分子在微波電磁場中快速轉(zhuǎn)向及定向排列，從而產(chǎn)生撕裂和相互摩擦發(fā)熱，正是這種劇烈運動導致植物細胞內(nèi)部結構發(fā)生破壞，有助于多糖成的溶出，從而大大縮短提取時間。因此，在微波作用下富含水的部分優(yōu)先破壁，而含水少的細胞則比較滯后，甚至不能被微波破壁，所以微波處理時間的延長可以增加這種極性溶劑分子間的摩擦，使其對植物細胞內(nèi)部結構的破壞程度加劇。但是微波處理時間過長就會導致水分蒸發(fā)過快，從而使得細胞內(nèi)多糖的提取難以進行，并且也可能導致多糖活性的降低。單因素實驗也發(fā)現(xiàn)，當微波處理時間超過180S后，茶多糖得率有逐漸下降的趨勢。因此，對鐵觀音茶多糖的提取，合適的微波處理時間為180S。
表1微波提取茶多糖正交實驗結果
表2微波提取茶多糖正交實驗方差分析
實驗結果表明，隨著料液比的減小，鐵觀音茶多糖的得率先增后降，在D2水平達最大值。多糖從茶葉細胞到溶劑是一個由濃度差推動的擴散過程，料液比較大時，固液相中有效成分的濃度差偏小，提取過程中傳質(zhì)速度慢，多糖溶人溶劑的量少；隨著料液比的減小，兩相濃度差增大，傳質(zhì)速度加快，擴散到溶劑里的多糖就越多。但是，從細胞中提取多糖的過程除了簡單的擴散過程之外，還有受細胞膜影響的阻滯擴散過程，而阻滯擴散速度取決于細胞膜結構。增加溶劑用量雖然在一定程度上增大濃度差推動力，能促進多糖的提取，但是起決定作用的細胞膜結構并沒有變化，反而可能會使細胞中其他物質(zhì)溶出的機率加大，導致多糖得率降低。而且溶劑用量太多會對后面的純化工作帶來不利影響，因而，本實驗選擇料液比為1：30。正交實驗結果表明，水浴浸提溫度對得率影響不大，在C，水平時達最大值。浸提溫度主要通過擴散系數(shù)來影響多糖得率，而溫度與擴散系數(shù)正相關，因此要想獲得較高的擴散速率，就必須設法升高提取溫度，并且對于植物來源的多糖，溫度升高可以增加植物細胞膜的通透性，有利于多糖的浸出。不過溫度過高也會使過多的雜質(zhì)溶出，不但增加分離難度，而且容易導致某些有效成分失活。對鐵觀音茶多糖的提取，水浴浸提溫度選取6O℃較適宜，
表2表明，微波功率對多糖得率有極顯著影響，微波時間和料液比對粗多糖得率均有顯著影響，各因素對得率的主次影響順序是：A（微波功率）>D（料液比）>B（微波時間）>C（水浴浸提溫度），各因素的最佳水平組合為AB，c，D，即：微波功率375W，微波時間180s，水浴浸提溫度6O℃，料液比1：30。采用此條件進行3次驗證實驗，得到粗多糖的平均得率為2。82％。
2.2茶多糖的抗氧化活性
圖1和圖2表明，鐵觀音茶多糖具有較好的清除O2ˉ·和·OH自由基效果，并且隨著粗多糖濃度的增加，清除率逐漸增強，即，鐵觀音茶多糖對O2ˉ·和·OH的清除能力與其濃度具有明顯的量效關系，并且微波處理前后，鐵觀音茶多糖的清除自由基效果并沒有顯著差異（P>0。05）。圖1中，在低濃度條件下，鐵觀音茶多糖對鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的O2ˉ·抑制作用較弱，但在高濃度條件下具有明顯的抑制作用，其對O2ˉ·的半數(shù)清除質(zhì)量濃度IC50約為600ug/ml，而當質(zhì)量濃度為1000ug／mL時超氧陰離子清除率達到69％。圖2中，茶多糖濃度較低時，劑量一效應線性關系較好，隨濃度增加，·OH清除率增加較快，當濃度增加到一定程度后，對-OH的抑制率增加緩慢，劑量一效應不符合線性關系，其對·OH的半數(shù)清除質(zhì)量濃度IC50約為500ug／mL，在實驗濃度范圍內(nèi)，茶多糖對羥自由基的最大清除率為78％。
圖1鐵觀音茶多糖對02-·的清除效
圖2鐵觀音茶多糖對·OH的清除效
O2ˉ·是生物體內(nèi)主要的活性氧自由基，也是人體內(nèi)由氧衍生出來的第一個氧自由基。·OH是已知活性氧中對生物體毒性最強的一種自由基，對細胞內(nèi)DNA的破壞作用最大，可造成堿基被破壞，從而產(chǎn)生遺傳突變。近年來關于茶多糖抗氧化作用的報道越來越多，并有人據(jù)此解釋了茶多糖多種生物學功能的藥理學基礎，這些報道都表明，茶多糖的抗氧化作用和它的結構有密切關系。研究表明，茶多糖是含有10％左右蛋白質(zhì)的糖蛋白，組成單糖以半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖為主，還有木糖和甘露糖等，其抗氧化作用機制可能是茶多糖中的一些活性位點（如帶有酚羥基的氨基酸）捕捉了自由基或與之產(chǎn)生氧化還原反應，或茶多糖大分子將自由基包埋起來使其無法進行氧化反應。
同時，由于茶多糖結構中存在大量的羥基和羧基，對過渡金屬離子具有較強的絡合作用，終止了自由基的鏈式反應，從而對自由基顯示出較強的清除作用。另外，一般認為，高級結構呈螺旋狀的多糖活性較高，而呈可拉伸帶狀或皺紋型帶狀的多糖活性一般較低甚至沒有活性，三股螺旋構型是多糖最具活性的空間構象，而有報道發(fā)現(xiàn)茶多糖在水溶液中以有序的螺旋構象存在，這是否是茶多糖具有抗氧化活性的結構基礎，有待進一步深人研究。
3結論
1）用微波輔助提取鐵觀音茶多糖，通過四因素三水平正交實驗對微波處理條件進行優(yōu)化，結果表明，影響得率的因素主次順序是：微波功率>料液比>微波時間>水浴浸提溫度；確定最佳的提取工藝條件為：微波功率375W，微波時間180S，水浴浸提溫度60℃，料液比1：30。
2）抗氧化活性結果表明，鐵觀音茶多糖對O2ˉ·和·OH有較好的清除效果，其清除能力與多糖質(zhì)量濃度有明顯的量效關系，實驗范圍內(nèi)的微波處理對其抗氧化活性無顯著影響（P>0.05）。
3）與傳統(tǒng)多糖提取技術相比，微波輔助提取技術可以大大縮短提取時間，具有節(jié)能、提取效率高等優(yōu)點，并且，適量的微波處理對茶多糖的抗氧化活性并無明顯影響。
